Flüoresan filtri floresan mikroskopun vacib komponentidir. Tipik bir sistemdə üç əsas filtr var: həyəcan filtri, emissiya filtri və dikroik güzgü. Onlar adətən bir kubda qablaşdırılır ki, qrup birlikdə mikroskopun içərisinə daxil olsun.
Floresan filtri necə işləyir?
Həyəcan filtri
Həyəcan filtrləri müəyyən bir dalğa uzunluğunun işığını ötürür və digər dalğa uzunluqlarını bloklayır. Onlardan yalnız bir rəngin keçməsi üçün filtri sazlayaraq müxtəlif rənglər istehsal etmək üçün istifadə edilə bilər. Həyəcan filtrləri iki əsas növdə olur - uzun keçid filtrləri və bant keçirici filtrlər. Həyəcanlandırıcı adətən yalnız flüorofor tərəfindən udulmuş dalğa uzunluqlarını keçən, beləliklə, flüoresansiyanın digər mənbələrinin həyəcanını minimuma endirən və flüoresan emissiya zolağında həyəcan işığını bloklayan bir bant keçirici filtrdir. Şəkildə mavi xətt ilə göstərildiyi kimi, BP 460-495-dir, yəni o, yalnız 460-495nm floresandan keçə bilər.
O, flüoresan mikroskopun işıqlandırma yoluna yerləşdirilir və flüorofor həyəcanlandırma diapazonu istisna olmaqla, işıq mənbəyinin bütün dalğa uzunluqlarını süzür. Süzgəcin minimum ötürülməsi şəkillərin parlaqlığını və parlaqlığını diktə edir. Hər hansı həyəcan filtri üçün minimum 40% ötürülmə tövsiyə olunur ki, ötürülmə ideal olaraq >85% olsun. Həyəcan filtrinin bant genişliyi tamamilə flüorofor həyəcanlandırma diapazonu daxilində olmalıdır ki, filtrin mərkəzi dalğa uzunluğu (CWL) flüoroforun pik həyəcan dalğa uzunluğuna mümkün qədər yaxın olsun. Həyəcan filtrinin optik sıxlığı (OD) fon şəklinin qaranlığını diktə edir; OD, bir filtrin ötürmə diapazonundan və ya bant genişliyindən kənar dalğa uzunluqlarını nə qədər yaxşı blokladığının ölçüsüdür. Minimum OD 3.0 tövsiyə olunur, lakin 6.0 və ya daha böyük OD idealdır.
Emissiya Filtri
Emissiya filtrləri nümunədən arzu olunan flüoresansın detektora çatmasına imkan vermək məqsədinə xidmət edir. Onlar daha qısa dalğa uzunluqlarını bloklayır və daha uzun dalğa uzunluqları üçün yüksək ötürmə qabiliyyətinə malikdirlər. Filtr növü də rəqəmlə əlaqələndirilir, məsələn, şəkildəki BA510IF (müdaxilə maneə filtri), bu təyinat onun maksimum ötürülməsinin 50%-də dalğa uzunluğuna aiddir.
Həyəcan filtrləri üçün eyni tövsiyələr emissiya filtrləri üçün də keçərlidir: minimum ötürmə, bant genişliyi, OD və CWL. İdeal CWL, minimum ötürmə və OD kombinasiyası ilə emissiya filtri mümkün olan ən dərin bloklama ilə mümkün olan ən parlaq təsvirləri təmin edir və ən zəif emissiya siqnallarının aşkarlanmasını təmin edir.
Dikroik güzgü
Dikroik güzgü həyəcan filtri ilə emissiya filtri arasında 45° bucaq altında yerləşdirilir və emissiya siqnalını detektora ötürərkən həyəcan siqnalını flüorofora doğru əks etdirir. İdeal dikroik filtrlər və şüa ayırıcılar həyəcan filtrinin bant genişliyi üçün >95% əks və emissiya filtrinin bant genişliyi üçün >90% ötürmə ilə maksimum əksetmə və maksimum ötürmə arasında kəskin keçidlərə malikdir. Səhv işığı minimuma endirmək və flüoresan görüntü siqnalının səs-küy nisbətini artırmaq üçün flüoroforun kəsişmə dalğa uzunluğunu (λ) nəzərə alaraq filtr seçin.
Bu rəqəmdəki dikroik güzgü DM505-dir, belə adlandırılmışdır, çünki 505 nanometr bu güzgü üçün maksimum ötürülmənin 50%-də dalğa uzunluğudur. Bu güzgü üçün ötürmə əyrisi 505 nm-dən yuxarı yüksək ötürülmə, 505 nanometrdən sola ötürülmədə kəskin azalma və 505 nanometrdən sola maksimum əksetmə qabiliyyətini göstərir, lakin yenə də 505 nm-dən aşağı bəzi ötürülmələrə malik ola bilər.
Uzun keçid və bant keçid filtrləri arasında fərq nədir?
Flüoresan filtrləri iki növə bölmək olar: uzun keçid (LP) və bant keçidi (BP).
Uzun keçid filtrləri uzun dalğa uzunluqlarını ötürür və daha qısa olanları bloklayır. Kəsmə dalğa uzunluğu pik ötürülmənin 50% dəyəridir və kəsilmədən yuxarı olan bütün dalğa uzunluqları uzun keçid filtrləri tərəfindən ötürülür. Onlar tez-tez dikroik güzgülərdə və emissiya filtrlərində istifadə olunur. Tətbiq maksimum emissiya toplamanı tələb etdikdə və spektral ayrı-seçkilik arzuolunmaz və ya zəruri olmadıqda, uzunkeçirici filtrlərdən istifadə edilməlidir, bu ümumiyyətlə fon avtoflüoressensiyasının nisbətən aşağı səviyyələri olan nümunələrdə tək emissiya növləri yaradan zondlar üçün belədir.
Bant keçid filtrləri yalnız müəyyən bir dalğa uzunluğu bandını ötürür və digərlərini bloklayır. Onlar flüorofor emissiya spektrinin yalnız ən güclü hissəsinin ötürülməsinə imkan verməklə çarpışmanı azaldır, avtoflüoresan səs-küyünü azaldır və beləliklə, uzun keçid filtrlərinin təklif edə bilmədiyi yüksək fon avtoflüoresan nümunələrində siqnal-küy nisbətini yaxşılaşdırır.
BestScope neçə növ flüoresan filtr dəstini təmin edə bilər?
Bəzi ümumi filtr növlərinə mavi, yaşıl və ultrabənövşəyi filtrlər daxildir. Cədvəldə göstərildiyi kimi.
| Filtr dəsti | Həyəcan filtri | Dikroik güzgü | Baryer filtri | LED lampanın dalğa uzunluğu | Ərizə |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Floresan antikor metodu · Turşu portağalı: DNT, RNT ·Auramin: Vərəm çöpü ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Floresan antikor metodu ·Propidium yodid: DNT · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Avto-flüoresan müşahidə ·DAPI: DNT boyanması ·Hoeches 332528, 33342: Xromosomların rənglənməsi üçün istifadə olunur |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katexolaminlər ·5-hidroksi triptamin ·Tetrasiklin: Skelet, Dişlər |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Flüoresan qəbullarında istifadə olunan filtr dəstləri ən çox istifadə olunan flüoroforlara əsaslanan flüoresan tətbiqlərində istifadə olunan əsas dalğa uzunluqları ətrafında hazırlanmışdır. Bu səbəbdən, onlar həmçinin DAPI (mavi), FITC (yaşıl) və ya TRITC (qırmızı) filtr kubları kimi görüntüləmə üçün nəzərdə tutulmuş flüoroforun adını daşıyırlar.
| Filtr dəsti | Həyəcan filtri | Dikroik güzgü | Baryer filtri | LED lampanın dalğa uzunluğu |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Qırmızı | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Floresan filtrini necə seçirsiniz?
1. Flüoresan filtrinin seçilməsi prinsipi flüoresans/emissiya işığının görüntüləmə ucundan mümkün qədər keçməsinə imkan vermək və eyni zamanda həyəcanlandırma işığını tamamilə bloklamaqdan ibarətdir ki, ən yüksək siqnal-küy nisbətini əldə etsin. Xüsusilə multifoton həyəcanlandırma və ümumi daxili əks mikroskopun tətbiqi üçün zəif səs-küy də görüntüləmə effektinə böyük müdaxiləyə səbəb olacaq, buna görə də siqnalın səs-küy nisbətinə olan tələb daha yüksəkdir.
2. Flüoroforun həyəcan və emissiya spektrini bilin. Qara fonda yüksək keyfiyyətli, yüksək kontrastlı təsvir yaradan flüoresan filtr dəsti qurmaq üçün həyəcanlandırma və emissiya filtrləri flüorofor həyəcanlanma zirvələrinə və ya emissiyalarına uyğun gələn bölgələr üzərində minimal ötürmə zolağı dalğalanması ilə yüksək ötürülmə əldə etməlidir.
3. Flüoresan filtrlərin davamlılığını nəzərə alın. Bu filtrlər ultrabənövşəyi (UV) işığı yaradan intensiv işıq mənbələrinə qarşı keçilməz olmalıdır ki, bu da işıqlandırma mənbəyinin tam intensivliyinə məruz qaldığından, xüsusilə həyəcanlandırıcı filtrin “tükənməsinə” səbəb ola bilər.
Fərqli Floresan Nümunə Şəkilləri
Resurslar İnternetdə toplanır və təşkil edilir və yalnız öyrənmə və ünsiyyət üçün istifadə olunur. Hər hansı bir pozuntu varsa, silmək üçün bizimlə əlaqə saxlayın.
Göndərmə vaxtı: 09 dekabr 2022-ci il